10X Geonomics

    10x Genomics Chromium Controller 应用微流体芯片将样品进行快速分区，而后添加序列标签，对样品进行定相结构变异分析、单核苷酸变异及插入分析，以及对数万个单细胞进行动态基因表达谱分析。可检测来源于同一细胞中表达谱，同时可以检测单细胞水平基因拷贝数变异和开放染色质。

主要性能：

1、一张芯片具有 8 个独立的通道，可供 8 个样本同时上机，每个通道可捕获 10000 个细胞。

2、双细胞概率低：细胞的最小尺寸没有限制，细胞捕获效率可以达到65%，0.9%每1000个细胞

3、将多样的条形码文库与大量样本整合成微滴，可以在几分钟内生成大于100,000个包含条形码和样本的微滴

4、兼容Illumina测序系统

凝胶磁珠：

    介绍10X Genomics技术流程前，⾸先介绍Gel bead（凝胶磁珠）。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的⼀段引物构成，引物序列构成依次为：全 长Illumina TruSeq Read 1 测序引物、16nt 10X Barcode序列（每个Gel bead的10X Barcode均不相同，形成GEM（Gel Beads-in- emulsion）后⽤于区分细胞）、12 nt unique molecular identifier (UMI) （区分同⼀细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，实现绝对定 量）、30 nt poly dT反转录引物。

测序原理：

    Barcode标记不同的单细胞，UMI标记不同的转录本。通过微流控、油滴包裹和barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获和标记，从而获得每个细胞的RNA/DNA 信息。

CHROMIUMTM 系统的分析技术特点

1、高效生成 100-80,000+ 个单细胞

2、出色的灵敏度，且细胞捕获率高达65%

3、简单的实验流程

4、对细胞大小要求更灵活，不设下限

5、双重率低，每1,000个细胞低于0.9%

技术流程：

（1）制备好的细胞悬液、10Xbarcode凝胶磁珠和油滴分别加⼊到ChromiumChipB的不同⼩室（下图左），经由微流体“双⼗字”交叉系统形成GEM（下图右）。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700-1200细胞/ul，因此产⽣的90-99%GEM不含有细胞，剩下的⼤部分GEM含有⼀个细胞；

（2）单个GEM依次形成后再全部混合，细胞裂解，凝胶珠⾃动溶解释放⼤量引物序列；

（3）释放的引物中包含30ntpolydT反转录引物，带有polyA的RNA被反转录为带有10XBarcode和UMI信息的cDNA⼀链，再以SMART⽅式完成⼆链合成；

（4）油滴破碎，磁珠纯化cDNA⼀链，然后PCR扩增cDNA；

（5）cDNA扩增完成后酶切⽚段化并磁珠筛选最适⽚段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，再以PCR⽅式构建含有P5和P7接头的cDNA⽂库；