技术原理
基于10X Genomics平台的高通量单细胞RNA-Seq技术是利用液滴法的原理，使用GemCode技术，通过控制微流体的进入，将带有barcode、UMI（Unique Molecular Index，分子标签）、引物及酶的凝胶珠（Gel Beads）与单细胞混合，从而实现大规模的单细胞分离，以及单细胞文库构建的技术。
图1 10X Genomics技术原理示意图
10X Genomics平台的液滴封装大约有50%的捕获效率，可在6分钟内完成。分离完成后会形成一个GEM（Gel in Emulsion）的液滴结构，在这个液滴结构内，包含了一个凝胶珠，一套反应需要的试剂以及目标细胞，通过一套75万个barcode序列系统地对每个液滴进行唯一标记，随后上机测序，再利用信息分析的方法进行barcode序列的拆分，可实现一次100-10000个细胞的分离和文库构建。
实验流程
首先将样本制备成单细胞悬液，随后进行上机前细胞计数和细胞活率检测，若细胞活率≥80%，则将细胞浓度调整为700-1200个／μL。将制备好的细胞悬浮液利用微流控芯片，将带有细胞标签序列（cell Barcode）的凝胶珠（bead）和细胞包裹在液滴中。在液滴中，细胞破裂，释放的mRNA与凝胶珠上的细胞标签序列相连，形成单细胞GEMs结构（Gel Bead in Emulsions）。细胞的mRNA在液滴中进行逆转录反应形成cDNA，随后破乳，进行 cDNA 的文库构建。通过文库序列上的细胞标签序列可以区分目标序列来自于哪一个细胞。
细胞和反应试剂在微流控芯片上的一条通道中，凝胶珠在另一条通道，共同形成GEM。在每个GEM中独立进行反转录，之后带有标签的 cDNA 将被混合然后扩增再进行文库构建。
图2 GemCode平台单细胞RNA-Seq工作流程图
信息分析流程
测序得到的原始数据称之为Raw reads，之后会根据10X Genomics单细胞RNA-Seq独特的文库结构，对Reads的Barcode 、 UMI 和插入片段部分进行拆分，之后插入片段部分将比对到参考基因组，然后统计比对到各个区域的比例，并进行表达量统计；基于表达量的结果，进行细胞聚类、细胞类群拟时间轨迹预测、细胞通讯、RNA速率等分析，基于差异表达的结果，进行KEGG富集，GO富集析等。
表1 信息分析内容
1、细胞亚群分类
图1 细胞分类注释图
2、特异marker基因分析
图2 cluster特异marker基因小提琴图
3、样本间cluster差异表达基因分析
图3 根据选定的显著9个基因进行表达量热图展示
4、样本间相同cluster基因差异基因分析
图4 样品间相同细胞类型差异基因小提琴图
5.CNV分析
图5 CNV分析
6. 细胞通讯
图6 左 互作网络图 右 互作circos图
7. RNA速率分析
图7 RNA速率分析
8. 轨迹分析与拟时间分析
图8 左 拟时间序列分析图，右 拟时间序列在所有细胞类型中的分析图
DLAB实验室自有Illumina、ABl测序平台、Quanta扫描电镜、Guava流式细胞 仪、IVIS活体成像仪等顶尖设备。可做测序、细胞、动物、病理实验。
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